سايت شهر دامغان

مقالات پزشکي سايت

ارسال کننده : محمد صادقي ( کارشناس پزشکي )

عنوان : تشخيص فرمهاي قابل كشت و غير قابل كشت باكتري شيگلا با استفاده از PCR

چكيده

در حال حاضر تشخيص شيگلو عمدتا بر پايه روشهاي ميكروبيولوژيك ( سروتاپينگ ) انجام مي‌گيرد .

اساس روشهاي ميكروبيولوژيك جداسازي باكتري از نمونه هاي باليني ( عمدتاً ) مدفوع و مواد غذائي آلوده است . كشت روشي طولاني است و باكتري به شرايط محيطي تقريباً حساس است به سرعت توانايي رشد و تشكيل كلني را از دست مي دهد بنابراين با روشهاي مرسوم كشت ناشناخته مي ماند . است به طور كلي نتايج مطالعات حاكي از آنند كه جالتهاي غير قابل كشت باكتريهاي بيماريزا و از جمله شيگلا وجود دارند . شيگلا يكي از باكتريهاي مورد توجه در بيوتر و ريسم نيز مي باشد . آمپليفيكاسيون DNA به روش PCR راهي براي تشخيص عوامل عفوني از جمله باكتري مي باشد روشهاي مولكولي از جمله تكنيك PCR قادرند باكتري را در مقادير كم شناسايي كنند نوع غير قابل كشت آنها نيز با اين روشها كاملا شناسايي مي شوند . به همين دليل كارآيي اين تكنيك در تشخيص فرمهاي قابل كشت و غير قابل كشت باكتري شيگلا مورد ارزيابي قرار گرفت معمولا تفاوتي بين آمارهاي ارائه شده از مبتلايان به بيماريها از جمله اسهال شيگلائي با آمار صحيح آن وجود دارد . صرف نظر از اشكالات تكنيكي وجود باكتريهاي غير قابل كشت علت اين تفاوت است كه در محيطهاي آزمايشگاهي مرسوم كلني ايجاد نمي كنند . بنابراين مطالعه بر روي انواع غير قابل كشت باكتريها از جمله شيگلا كه با روشهاي روتين كشت در محيط هاي آزمايشگاهي قابل شناسايي نيستند حائز اهميت مي باشد . فاكتورهاي ممكن جهت القاي پروسه برگشت پذير كردن باكتريها به حالت قابل كشت نيز شناخته شده است . فلذا مطالعه خواص و رفتار فرم هاي غير قابل كشت باكتريها و همچنين فاكتورهاي محيطي موثر بر آنان در طي زمان براي برگرداندن باكتريهاي غير قابل برگشت به حالت نرمال ( قابل كشت ) نيز با اهميت است .

مقدمه

زماني كه باكتريها در برابر استرسهاي محيطي نظير فقر غذايي قرار بگيرند واكنشهاي مختلفي از خود نشان مي دهند كه يكي از تبديل شدن باكتريها به( VBNC ) Viable but nonculturadle مي باشد . اين پديده در مورد باكتريهاي مختلف از جملهVibrio vulnificus , Shigella dysenteriae 1 , Enterococcus faecalis Vibrio cholerae Ol , Salmonella enteritidis Campylobacter jejeuni , گزارش شده است (3,2,1) . با توجه به اينكه احتمال برگشت اين باكتريها به فرم قابل كشت خودشان وجود دارد . فلذا امكان استفده از اين پديده فيزيولوژيك و همچنين توليد چنين باكتريهايي با روش مهندسي ژنتيك ( عوامل جديد تغيير ژنتيكي يافته GMMO s و به كارگيري آنها به عنوان عوامل بيوتروريسم وجود دارد .

مسلما اين عوامل به گونه اي طراحي مي شوند كه با روشهاي معمولي تشخيص و شناسايي استاندارد نتوان آنها را تشخيص داد و با آنها مقابله كرد با توجه به تاثير شناسايي و يا عدم شناسايي عامل عفوني در روشهاي درماني بايد راهكارهايي را به منظور شناسايي تشخيص و اعلام خطرهاي به موقع حمله احتمالي توسط عوامل فوق را فراهم نمايئم .

مواد و روشها :

در اين مطالعه حدود 500 نمونه مدفوعي مشكوك به شيگلوزيس از بيمارستانها و مراكز درماني و همچنين مركز طبي كودكان تهران جمع آوري گرديد و پس از انتقال به بخش ميكروبيولوژي سمنان مورد شناسايي دقيق قرار گرفت سروتايپينگ نمونه هاي مثبت با استفاده از آنتي سرمهاي شيگلا كه از شركتهاي « بهار افشان و كوشافرآور گيتي » تهيه شده بود انجام شد با مرور گزارشهاي متعدد در مورد ژنهاي مختلف شيگلا كه بعضا هماهنگي نيز با هم ندارند در پي يافتن يك الگوريتم جهت شناسايي و تشخيص باكتريهاي شيگلا با استفاده از تكنيك PCR هستيم در اين مطالعه در نهايت پرايمرهايي بر اساس چهار ژنIpaH , 16SrRNA , ShigaAVir , تهيه گرديد و كارآيي آنها در 100 نمونه كلينكي مشكوك به شيگلازيس ارزيابي مي شود . در نمونه هاي كلينيكي مدفوع به 8 روش مواد وراثتي تخليص ارزيابي گرديد و پروتكل شماره 5 براي تهيه Genomic DNA از مدفوع استفاده شد .

نتايج :

نتايج اوليه حاكي از Set up هر PCR 4 با سويه هاي استاندارد مي باشد . همچنين نتايج PCR با IpaH نشان مي دهد كه اين ژن در 22 % نمونه هاي كشت منفي هم وجود دارد .

كلمات كليدي :

شيگلا ، غير قابل كشت ، PCR

مواد و روشها

حدود 3 ميلي ليتر مدفوع از بيماران مبتلا به اسهال خوني ( مدفوع اسهالي همراه با خون و مخاط كه اثري از انگل آنتامبا هيستوليتيكا در آن ديده نمي شد ) . از كليه گروه هاي تحت مطالعه گرفته شد ؛ با بافر حجم آن به ده ميلي ليتر رسانيده شده كاملا يكنواخت مي گرديد . سپس در محيطها كشت مي شد . محيطها به مدت 3 روز بررسي مي شدند . 3 ميلي ليتر مدفوع در –20 نگهداري مي شد . در اين پژوهش بر روي حدود 500 نمونه كار شد كه در 50 مورد از آنان وجود شيگلا با كشت ثابت شد .

روش تشخيص باكتريولوژيك

مدفوع افراد مبتلا يا مشكوك به اسهال خوني باسيلر بصورت مستقيم در محيطهاي كشت Mac conkey agar & SS agar و همچنين در محيط GN broth ( 4 – 6hr ) و سپس از اين محيط در محيطهاي مكانكي و سپس محيطهاي افتراقي كشت شد . سپس از كلني هاي مشكوك در محيطهاي افتراقي از جمله ليزين دكربوكسيلاز كشت شد . در مواردي كه نتايج آزمونهاي بيوشيميايي منطبق با موارد مورد انتظار براي گونه هاي شيگلا بود ( كلنيهاي تاييد شده ) مورد آزمون سروتپينگ قرار گرفتند .

مواد وراثتي از ميكروبهاي تشخيص داده شده ( شيگلا و . . . ) به روشهاي مختلف استخراج گرديد . DNA جداسازي شده به روش اسپكتروفتومتريك تعيين غلظت شدند . سپس انجام PCR و مقايسه PCR روي سكانسهاي مختلف Shigella و ارزيابي آنها در تشخيص عوامل اتيولوژيك Shigellosis از جمله :

تكثير يك قطعه 215 نوكلئوتيدي از ژن vir A جهت غربالگيري سويه هاي بيماريزاي شيگلا.

تكثير يك قطعه 755 نوكلئوتيدي از ژن 16 s rRNA جهت غربالگيري سويه هاي بيماريزاي شيگلا.

تكثير يك قطعه 432 نوكلئوتيدي از ژن Shiga با استفاده از پرايمرهاي Shig –1/shig-2 .

تكثير يك قطعه 700 نوكلئوتيدي از ژن H(lpaH) با استفاده از پرايمرهاي Invasion plasmid antigen H8/H15 به منظور غربالگري سويه هاي غير قابل كشت شيگلا .

مورد نظر بود . پايان نتايج و كارآيي PCR روي سكانسهاي مختلف اين باكتري در تشخيص عوامل اتيولوژيك Shigellosis مورد بررسي و ارزيابي قرار گرفت .

نتايج :

بر اساس نتايج آزمون هاي باكتري شناسي و كشت وجود شيگلا در50 نمونه مدفوعي مثبت و در الباقي منفي گزارش شد كشت در محيط ليزين دكربوكسيلاز به منظور افتراق اين باكتري از E.coli كه خيلي به آن نزديك است . و رد استفاده قرار گرفت . توانايي شيگلا در اكسيداسيون ( دكربوكسيلاسيون ) ليزين باعث مي شود كه اسيد حاصل از تخمير گلوكز با خاصيت قليايي NH4 حاصل از اكسيداسيون ليزين خنثي شود . نتايج استخراج DNA به روشهاي مختلف نيز نشان داد كه پروتكل 5 مورد استفاده در اين روش از روشهاي ديگر كارآمدتر است لذا مبناي استخراج DNA از همه نمونه ها قرار گرفت . پس از بررسي پرايمرها با برنامه هاي كامپيوتري ON _ LINE BLAST and ect و DNASIS , Oligo , GENRRUNNER , and ect در شرايط مورد نظر بر روي ژنوم استخراج شده واكنش انجام گرديد .

در شرايط بهينه شده باندهاي مورد نظر در ژل اگاروز مشاهده گرديد .

نتايج اين مطالعه نشان مي دهد كه

روشهاي مولكولي نظير PCR نسبت به روشهاي استاندارد باكتريولوژيك در تشخيص عوامل اتيولوژيك اسهال خوني باسيلر ارجح است .

حساسيت و ويژگي PCR نسبت به روشهاي استاندارد باكتريولوژيك در تشخيص عوامل اتيولوژيك اسهال خوني باسيلر بيشتر است .

ژن PCR براي تشخيص تعداد م باكتري شيگلا و حتي سويه هاي غير قابل كشت آن نيز مي‌توانند مورد استفاده قرار گيرند . به عنوان مثال PCR در %22 موارد كشت منفي نيز مثبت گرديد H8/H15 Invasion plasmid antigen با استفاده از پرايمرهاي H(lpaH)

بحث و نتيجه گيري :

تشخيص شيگلوز عمدتا برپايه روشهاي ميكروبيولوژيك و سروتاپينگ انجام مي گيرد . اساس روشهاي ميكروبيولوژيك يك جداسازي باكتري از نمونه هاي تشخيص عمدتا مدفوع و مواد غذايي آلوده است . روش معمول و روتين در تشخيص اين ميكروارگانيسم شامل جداسازي اوليهء باكتري در محيطهاي كشت مكانكي ويا EMB و سپس انجام آزمايشهاي تكميلي و تاييدي بر اساس خصوصيات بيوشيميايي از طريق كشت آنها در محيطهاي افتراقي و . . . است .

كشت هر چند در عفونتهاي حاد براحتي مثبت ميگردد اما اين روش داراي محدوديت هايي مي‌باشد . . . كشت روشي طولاني است و باكتري به شرايط محيطي تقريبا حساس است به سرعت توانايي رشد و تشكيل كلني را از دست مي دهد بنابراين با روشهاي مرسوم كشت ناشناخته مي ماند . همچنين خطر بالاي آلودگي پرسنل آزمايشگاهي نيز وجود دارد ، به ويژه آنكه فرمهاي بدون علامت و يا تخفيف حدت يافته ء شيگلوزيس در بين افراد خانواده مبتلايان ( تا حدود %75) (5 ) باعث مخفي ماندن اين نوع آلودگي مي شود . تحقيقات جديد بيانگر آن است كه ميكروارگانيسمهاي مختلف از جمله شيگلاها تحت تاثير شرايط و تحريكات مختلف محيطي نظير محدوديتهاي غذائي و . . . رفتاري متفاوت از خود بروز مي دهند ، عدم توانايي رشد باكتري زنده و يا عدم رشد به منظور عميق نشدن يك ضربه مرگ آور ( فعال شدن سيستم SOS ) در محيطهاي كشت آزمايشگاهي نمونه هايي از اين رفتار متفاوت مي باشد ( باكتريهاي Viable but non – culturable /VBNC ) . اين باكتري ها حداقل از دو جنبه اهميت دارند :

اولا مي توانند درصد قابل توجهي از باكتري مربوطه را تشكيل دهند ( حدود % 40 ( مندل 98 )- % 90 (4 ) ثانيا مي توانند به حالت قابل كشت برگشت نمايند . فلذا اين باكتريها علاوه بر آنكه باعث اخطار در تحقيقات مي شوند ( موارد قابل كشت باكتري شيگلا كه با روشهاي استاندارد باكتريولوژيك قابل تشخيص است ، نسبت به كل موارد آن رقم ناچيزي را تشكيل مي دهد مثلا % 12 – 11 در يك بررسي 10 ساله در بنگلادش ) .

آمپليفيكاسيون DNA به روش PCR راهي براي تشخيص عوامل عفوني از جمله اين باكتري است . محققين آمپليفيكاسيون سكانسهايي از ژنهاي مختلف بر روي DNA استخراج شده از نمونه هاي غذائي و همچنين نمونه هاي مدفوع انساني به منظور تشخيص اين باكتري انجام داده‌اند .

در مطالعه اي PCR توانسته است گونه هاي شيگلا و EIEC را در %22 تماسهاي خانوادگي بيماران مبتلا به ديسانتري و ناقلين رديابي نمايد ، در صورتيكه در همان جمعيت كشت فقط توانسته است تنها % 6 آنان را رديابي نمايد (3 ) . اين نكته ضمن آنكه تائيدي بر بالاتر بودن حساسيت روش PCR نسبت به كشت مي باشد ، بيانگر وفور و اهميت گونه هاي غير قابل كشت نيز مي باشد كه تنها با روشهاي مولكولي مي توان آنان را تشخيص داد ، علاوه بر آن روشهاي مولكولي از جمله PCR قادرند با تاييد و افتراق اسهالهاي باكتريايي از اسهالهاي ويروسي ضرورت و يا عدم ضرورت درمان ضد ميكروبي را گوشزد نمايند . ( 6 )

در Eduardo vilialobo & Antonio Torros et.al ( Accession no.J01695 ) 1995 روش را بر اساس PCR ژن 16S rRNA باكتري شيگلا و همچنين بر اساس ژن vir A گزارش نمودند كه فقط قادر بود با DNA سويه هاي شيگلا و EIEC واكنش نمايد ولي با ساير باكتريها واكنش نمي داد ( ACCession NO.D26468) .

Hu0- Shu H.Houng و همكاران نيز يك واكنش زنجيره اي پليمر از تك مرحله اي را گزارش كردند ( 1997 ) . اين مطالعه با طراحي پرايمرهايي در پايه ء ژنهاي 16S Rrna&rcf انجام شد . اين مطالعه براي جداسازي سويه هاي مختلف شيگلا و EIEC از نمونه هاي مدفوعي طراحي شده بود . آنان همچنين پرايمرهايي بر پايهء I S6 30 Gene براي افتراق گونه هاي شيگلا را به كار گرفتند . از معايب اين پرايمرها حساسيت پايين ( 10000 باكتري در هر گرم مدفوع ) و عدم توانائي آنها در تشخيص تيپ 6 شيگلا فلگسنري بود . ( 4 )

Hary Sakellaris et.al از ژاپن با استفاده از پرايمرهاي ( SBA 1021 & SBA1023 ) ( و همچنين پرايمرهاي 4477/4480 ژن coding ) for Curli protein csg به عنوان يك عامل ويرولانس ( ادهسين ) و همچنين مقاومت به چند آنتي بيوتيك در سويه هاي مختلف شيگلا و EIEC گزارش نمودند آنان همچنين نشان دادند كه ژن فوق تحت تاثير استرسهاي مختلف مي باشد و بنابراين متحمل موتاسيونهاي حذفي و اضافي مختلف مي شوند فلذا ناپايدار است . به عبارت ديگر موتوسيونهاي Pathoadaptive باكتري شيگلا را تشكيل مي دهند (8 ) .

Lindqvist در سال 1997 در واشنگتن نيز شيگلا را با كمك ژن IpaH شناسايي كردند . انواع غير قابل كشت پاتوژنهاي ديگر نيز شناسايي شده است كه اين امر دال بر اهميت موضوع مي باشد .

از آنجائيكه دوز مناسب اين باكتري براي آلودگي و توليد بيماري كم است ( دوز لازم براي آلودگي حدود 200 ميكروارگانيسم است مطالعات اپيدميولوژيك نشان داده است كه دوز در % 40 موارد انساني حدود 10 ميكروارگانيسم است ). اين رقم ناچيز براحتي مي تواند در مواد غدائي آلوده فراهم شود . بنابراين انتشار اين بيماري را مي توان به عنوان معياري جهت ارزيابي ميزان رعايت سطح بهداشت تلقي كرد اين نكته در كنترل عفونتهاي بيمارستاني نيز حائز اهميت مي‌باشد. تكليف PCR مي تواند باكتري را در مقادير كم شناسايي كند . نوع غير قابل كشت آن نيز با اين روش كاملاً شناسايي مي گردد مطالعه بر روي انواع غير قابل كشت باكتريها از جمله شيگلا كه با روشهاي روتين كشت در محيط هاي آزمايشگاهي قابل شناسايي نيستند اما با توجه به اهميت و نقش آنها در درمان و همچنين استفادة احتمالي در بيوتروريسم حائز اهميت است . PCR ژن H(IpaH) با استفاده از پرايمرهاي H8M/H15M Invasion plasmid antigen كه در % 22 موارد كشت منفي نيز مثبت گرديد مثالي از اين نوع مي باشد .

بنابراين با توجه به اهميت موضوع و از آنجائيكه كشت نمي تواند تمام بيماران و ناقلين را شناسايي نمايد . ( موارد غير قابل كشت ) و يا تفكيكي بين سوئه هاي بيماريزا و غير بيماريزا قائل شود و از طرفي وقتگير هم ميباشد استفاده از روشهاي مولكولي كه فاقد محدوديتهاي فوق مي باشد در تشخيص موارد غير قابل كشت باكتريهاي بيماريزا و كانديداهاي بيوتروريسم نيز كاربرد دارد يك ضرورت است .

منابع :

1 – Nilsson L, Oliver JD kjelleberg S. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state , J. Bacteriol 1991 ; 173 :5054-9.

2 – Roszak DB , Grimes, DJ; Colwell , RR., Viable but non – recoverable Stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can J. Microbiol 1984;

30:334-8

3 – Wai SN, Moriya T., Kondo K., Misumi H., Amako K., Resuscitation of vibrio cholerae o1 strain TS1-4 from a viable but noncultrable state heat shock . FEMS Microbiology Letter , 1996 ; 136 : 187-191 .

4 – Islam - Ms

علي اكبر شعباني ، محمدرضا اكبري عيدگاهي ، غلامرضا ايراجيان

عضو هيئت علمي ، دانشگاه علوم پزشكي سمنان مركز تحقيقات بيوتكنولوژي

Damghan@Damghancity.com

نظرات و پيشنهاد هاي خود را حتما براي ما ارسال كنيد ... ( دفتر دامغان )